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ISSN : 1225-7672(Print)
ISSN : 2287-822X(Online)
Journal of the Korean Society of Water and Wastewater Vol.26 No.4 pp.591-598
DOI :

MLE와 A/O 공정에서의 nirS 와 nirK 를 가진 탈질미생물의 정량적 분포

임동석1, 김윤중2, 김형건3, 박승국1, 정태학4*
1 (주)한화건설 기술연구소, 2 (주)포스코건설 R&D센터 기술연구소, 3 (주)포스코건설 토목환경사업본무, 4 서울대학교 건설환경공학부

Quantitative distribution of denitrifying bacteria with nirS and nirK in MLE and A/O process

Chung Tai Hak4*, Lim Dong Seok1, Kim Yun Jung2, Kim Hyung Gun3, Park Seung Kook1

Abstract

Denitrification is an important biological mechanism in wastewater treatment process because this process is technically to remove nitrogen from water to air. There have been lots of study about denitrification engineering and molecular biological research about denitrifying bacteria, respectively. However, combination of these researches was unusual and rare. This study is about the correlation between quantity of denitrifying bacteria and denitrification potential, and consists of NUR batch test as analysis method of denitrification potential and quantitative molecular analysis for denitrifying bacteria. Three reactors (A/O, MLE and A/O of nitrogen deficiency) are operated to get activated sludge with various denitrification potential. All samples which were acquired from reactors were measured denitrification potential by NUR test and NUiR test. Also, Real-time PCR was conducted for quantification of denitrifying bacteria composition in activated sludge.
The various denitrification potentials were measured in the reactors. The denitrifiaction potential was the highest in MLE process and the reactor of the nitrogen deficiency showed the lowest.
Genomic DNA of activated sludge was obtained and consequently, real-time PCRuse the primer sets of nirK and nirS were conducted to quantify genes involving denitrification reductase production. As the result of real-time PCR, nirK gene showed more significant influence on denitrification potential comapred with nirS gene.

10 임동석 교수님.pdf1.52MB

1. 서 론

 탈질반응은 질산성 질소를 혐기적 환원과정을 통하여, 가장 많이 존재하며 안정적인 질소 기체로 만들어 대기 중으로 돌려보내는 과정으로써 생물학적 질소제거 과정의 한 축을 담당한다.(Geradi, 2002)

 탈질 반응의 단계에서 아질산성질소 (nitrite, NO2 - )를 산화질소 (nitric oxide, NO)로 환원하는 과정은 용존 이온 상태의 질소를 기체 상태로 환원한다는 점에서 실질적으로 수중에서 제거하기 때문에 가장 중요한 단계이며, 탈질능을 결정하는 단계이다. 종속영양 미생물의 물질대사에 관여하는 전자 수용체의 전기적 활성도 (electroactivity)에 관련하여 용존산소와 질산성 질소의 생물학적 이용도 (bioavailability)가 용존산소와 아질산성 질소의 생물학적 이용도에 비해 매우 크다는 점 역시 탈질 과정에서 이 환원단계의 중요성을 뒷받침한다. 탈질 박테리아에서 아질산성 질소를 일산화 질소 (nitric oxide 또는 nitrous oxide)로 환원하는 효소 (nitrite reductase)는 대표적으로 두 가지를 들 수 있는데, 하나는 nirS 유전자에 의해 전사된 cytochrome cd1 type nitrite reductase이며 다른 하나는 nirK 유전자에 의해 전사되고 구리(Cu)를 포함하는 nitrite reductase이다.(Coyne et al., 1989; Glockner et al., 1993; Yoshida et al., 2009) Nitrite reductase에 관여하는 이 두 가지 기능성 유전자는 한 종의 박테리아에 동시에 공존하지 않으며 16S rRNA와 마찬가지로 박테리아의 DNA에서 mRNA로 전사하는 공통으로 보존된 지역 (highly conserved DNA region)이 존재하기 때문에 이를 이용하여 유전자 탐침 (gene probe)을 설계하여 탈질 미생물을 동정하는 것이 가능하다.(Hallin and Lindgren, 1999; Bothe et al., 2000; Henry et al., 2004)

 다양한 군집구조를 갖는 활성슬러지의 경우 특정 DNA 시쿼스는 의미있는 수준의 정확도로 정량하기가 어렵다. 기존에는 dot blot hybridization를 사용하여 정량하였으나 그것은 민감도가 떨어지기 때문에 적절하지 못하다. 또 다른 방법으로 FISH에 의한 정량이 가능하나 비우점 미생물 그룹의 양의 정확한 결정을 하는 것이 가능하지 않기 때문에 범용적인 정량기법으로 적용하기에 한계가 있다. 그러나 real-time PCR이 개발된 이후 위와 같은 문제들이 해결되었으며, 이를 이용하여 target DNA의 빠르고 감도 높은 정량이 가능해 졌다. 이 방법은 현재 다양한 분야에서 미생물의 정량에 사용되고 있다.(Bothe et al., 2000; Philippot, 2002; Wilderer et al., 2002) Real-time PCR에서는 형광탐침이 달린 primer를 이용한 PCR 증폭산물을 실시간으로 모니터링하여 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 정량하기 때문에 PCR의 증폭속도 이론을 기초로 정확한 정량이 가능하다.

 본 연구에서는 최근 개발되고 연구되고 있는 다양한 기술들, 특히 분자생물학적 미생물 군집구조 분석 기법들을 통해 새로이 밝혀지고 있는 정보(김, 2009)들이 새로운 지식으로서 기존의 실용적인 공학기법들에 연계하는 길을 열고자 한다. 따라서 본 연구에서는 다양한 조건에서 활성슬러지 반응조들을 운전하여 탈질능과 탈질박테리아의 정량적 관계를 알아보고자 하였다.

2. 연구재료 및 방법

2-1. 연속반응조 구성 및 운전

 하수처리장에서 채취한 활성슬러지를 30 L 크기의 MLE 반응조에서 1 SRT (Sludge retention time)인 20일간 운전한 뒤, 정상적인 유입수 조건을 부여한 R1 (MLE), R2 (A/O)와 질소원을 주입하지 않은 R3 (A/O)의 세 개의 반응조로 분주하여 비교운전하였다. 세 개의 반응조로 분주를 실시할 때 30 L MLE공정의 MLSS는 6,200 mg/L이었으며, 분주 후 각 반응조의 MLSS 농도는 5,600 ~ 5,900 mg/L 분포를 보였다. 이 세 반응조는 24일 동안 운전되었고 운전 기간 동안 탈질능 측정을 위한 배치실험을 8일에 한번씩 총 3번 실시하였다. Fig. 1은 각 반응조의 모식도이며, 반응조에 주입한 인공하수 성상은 Table 1과 같다.

Fig. 1. Schematic diagram of reactors

Table 1. Composition of synthetic wastewater for bioreactor

Table 2. Condition of control reactors

2-2. 탈질능 측정실험

각 슬러지 시료의 탈질능을 측정하기 위한 배치실험은 두 가지 방법으로 실시하였다. 첫번째는 기존 연구자들이 실시했던 NO3--N을 주입하는 방법((Katarzyna and Bram, 1999; Chung et al., 1996))이고, 두번째 방법은 본 연구의 주요 관심사인 nitrite reductase에 의한 탈질능을 관찰하기 위하여 첫 번째와 동일한 실험순서에 NO3--N 대신 NO2--N을 주입하는 방법이다. NO2- -N를 주입한 실험은 NUiR test라고 명명하였다.

 NUR test와 NUiR test를 위해 각 반응조의 호기조에서 활성슬러지를 채취한 뒤 희석하여 1,500 ~ 2,000 mg MLSS/L로 맞추었다. 슬러지 시료 내 잔존하는 모든 질소성분과 용존유기물을 제거하기 위해 호기조건으로 1시간 교반하고 다시 혐기상태로 2시간동안 교반하여 DO 농도를 0 mg/L으로 조정하였고, pH는 7에 근접하도록 맞추었다. 각각 배치 측정을 위해 500 ml 삼각플라스크 여섯 개를 교반기 위에 올려놓고 NO3--N과 NO2--N을 각각 30 mg/L씩 주입하였고 COD(Glucose)는 150 mg/L를 주입하여 그 후 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240분 단위로 10 ml씩 실시간 채취하여 GF/C 필터로 거른 뒤 이온크로마토그래피(DX-500, Dionex, USA)를 사용하여 측정하였다.(Katarzyna and Bram, 1999; Chung et al., 1996)

2-3. Genomic DNA 추출 및 Real-time PCR

 NUR test 및 NUiR test 수행시 각 반응조의 호기조에서 2 ml씩 활성슬러지 시료를 채취하여 -70 ℃ 냉동고에 보관 후 분석하였다. 박테리아로 구성된 활성슬러지에서 유전자 물질을 얻기 위해서는 먼저, 활성슬러지 샘플에서 라이소자임(lysozyme)을 사용하여 peptidoglycan층을 제거한 후 상용화된 DNA extration kit(Wizard Genomic DNA purification kit, Promega, USA)를 사용하여 활성슬러지를 구성하는 박테리아 군집의 전체 genomic DNA를 얻었고, UV-spectrophotometer (Optizen 2120UV, Mechasys, Korea)를 사용하여 농도를 측정하였다.

 추출된 DNA를 template로 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 아질산성질소의 환원에 관여하는 탈질유전자인 nirS와 nirK를 타겟으로 하는 primer를 사용하였고 SYBR Green Ⅰ분석방법을 사용하였다. (Table 3 참조) 시약으로 SYBR GreenTM을 포함한 상용화된 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 사용하였다. 50 uL PCR-tube에 SYBR Green Supermix는 25 uL, primer는 1pmole/uL로 맞추어 5 uL씩 각각 주입하였다. DNA template의 농도는 2 ng/uL로 맞추어 5 uL를 주입하였다. Real-time PCR 기기는 Bio-rad사의 MyiQ Single-Color real-Time PCR Detection System을 사용하였으며 자세한 운전조건은 Table 4에 나타내었다. 본 실험에서는 일반 PCR과 다르게 마지막 사이클에서 58 ℃에서 0.5 ℃씩 증가시키면서 74회 반복하여 특성변성 곡선(melting curve)을 얻었다. 증폭된 생성물의 순도를 확인하기 위해 단일 melting curve peak을 확인하였다.

Table 3. Sequences of primers adopted for real-time PCR

Table 4. PCR conditions for real-time PCR

3. 실험결과 및 고찰

3-1. NUR test 결과

 3개의 다른 조건의 반응조에서 시료를 채취하여 COD농도는 150 mg/L로 맞추어 NO3--N과 NO2--N를 각각 30 mg/L씩 주입하여 batch 실험을 실시하였다. 반응조별로 대부분 비슷한 경향성을 나타내었고 시간이 지날수록 활성슬러지의 상태가 나빠져 탈질능이 점점 감소하는 경향을 보였다. 그중 대표성을 보이는 그래프를 Fig. 2과 Fig. 3에 나타내었다.

Fig. 2. NUR test result of 3 reactor

Fig. 3. NUiR test result of 3 reactor

 탈질능은 식 (1)과 (2)를 통해 산출하였다.(Katarzyna and Bram, 1999)

 여기서,

 Fig. 2를 통해 3개의 다른 조건의 반응조에서 탈질능의 차이를 확인하였다. MLE 공정이 A/O 공정보다 상대적으로 탈질능이 높았고 질소원이 결핍되었던 R3에는 탈질 미생물이 거의 사멸하여 RBCOD에 의한 탈질은 거의 일어나고 있지 않고 내생탈질만이 일어났다.(Katarzyna and Bram, 1999)

 Fig. 3의 NUiR test는 MLE공정과 A/O공정의 탈질능이 비슷하였다.

 탈질능에 대한 비교는 Table 5와 같다.

Table 5. Comparison of Denitrfication potential

3-2. Real-time PCR 결과

 Real-time PCR 분석을 통해 환경샘플에 nirS와 nirK를 가진 target gene들이 각 공정에서 얼마나 존재하는지를 정량적으로 분석하였다.

 초기 환경샘플(standard sample)의 농도는 nirS와 nirK의 primer로 각각 증폭하여 정제한 후 분광계(Optizen 2120UV, Mechasys, Korea)를 사용하여 측정하였고, 환경샘플의 초기 DNA농도는 1.475 ng/uL였다. 그 농도를 토대로 10배씩 6개로 희석하여 각각의 샘플에 nirS와 nirK의 primer를 적용하여 각각의 standard curve를 도출해냈다.(Fig. 4(A), (B) 참조)

Fig. 4. Standard curves and a result of real-time PCR

 모든 샘플에 대해 real-time PCR을 적용하여 얻어진 Ct(threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점)값을 환경샘플을 통해 얻어진 standard curve에 적용하여 각각의 농도를 산출할 수 있었다. Fig. 4(C)은 real-time PCR의 결과이다.

 각각의 곡선이 Y축에서 50 부분의 굵은 선과 만나는 부분의 x값이 Ct값이 된다.

3-3. 탈질 미생물의 정량적 도출

 모든 샘플을 real-time PCR하여 각각의 Ct값을 구한 후 standard curve를 통해서 각각의 농도를 산출하였다. 그러나 그때의 nirS와 nirK의 농도는 초기 DNA농도인 1.475 ng/uL를 기준으로 한 것이므로 샘플들의 원래 DNA농도로 환산하여 정량적인 양을 1 ng/ul의 DNA 당 nirS의 농도, nirK의 농도, 그리고 nirS와 nirK의 양을 합한 농도로 나타내어 Fig. 5에 탈질능과 비교하였다.

Fig. 5. Correlation between denitrifying bacteria and denitrification potential

 Fig. 5(A)를 통해 대부분의 탈질능에서 nirS를 가진 미생물의 농도는 거의 비슷한 것을 확인할 수 있다. 이것은 nirS의 경우 탈질 미생물에서 우점한다고 보고되고 있으나 탈질능에 관계없이 탈질능을 나타내기 위해 기본적으로 존재하는 탈질 미생물들의 대부분이 nirS을 가진 탈질 미생물이라는 것을 추측할 수 있다. 따라서, 탈질능에 있어 nirS를 가진 탈질 미생물들은 주류이나 탈질능을 영향을 미치는 주류는 아니라는 것을 추측할 수 있다.

 반면, nirK의 경우는 지금까지 연구된 탈질 미생물에서 30 %만 발견되었다고 보고되었으나 nirS보다 더 생리학적인 그룹과 생태학적 지위에서 더 많이 발견되었다고(Coyne et al., 1989; Glockner et al., 1993; Yoshida et al., 2009) 문헌에 보고되고 있다. 문헌을 전제로 Fig. 5(B)와 (C)를 보면 주어진 조건에 따라 그 종이나 양의 변화가 커지고 다양해지기 때문에 탈질 미생물의 정량적 농도에 의해 탈질능이 더 영향을 준다고 판단된다. 그러므로 nirK를 가진 탈질 미생물이 탈질능에 영향을 미치는 주류라는 것을 확인할 수 있다.

4. 결론

 본 연구는 기존의 탈질능을 연구하였던 공학적인 분석과 탈질 미생물 자체에 대해 연구하였던 분자생물학적인 분석의 괴리를 탈질능과 탈질 미생물의 정량관계를 도출해 냄으로서 다른 학문분야였던 두 분석방법의 연결고리를 찾았다는 것에 큰 의의가 있다고 할 수 있다.

 본 연구를 통하여 도출한 결과를 다음에 나타내었다.

 (1) 1차 연속반응조 실험을 통해 3개의 반응조 2차 연속반응조 실험을 통해 6개의 반응조를 운전하여 다양한 활성슬러지를 확보하여 탈질능 실험인 NUR test와 본 연구에서 명명한 NUiR test를 실시하였다. 그 결과 다양한 탈질능의 값을 얻을 수 있었다. NUR test와 NUiR test의 결과 MLE 반응조에서의 탈질능이 A/O반응조에서 보다 높았다. 이것은 MLE반응조의 내부반송 때문에 호기조에 있던 NO3--N가 무산소조로 이동하여 탈질이 되기 때문에 탈질 미생물이 더 적합하게 성장하였기 때문으로 판단된다. 또한 질소성분이 결핍된 반응조에서는 탈질능이 매우 낮았다. 이것 역시 탈질 미생물과 관련이 있는데, 미생물 성장의 필수요소인 질소성분이 없어 반응조에서 탈질 미생물이 덜 성장하였기 때문이다.

 (2) Real-time PCR를 통해 반응조 운전간 얻어진 모든 샘플의 nirS와 nirK를 가진 탈질 미생물의 양을 정량화 했다. 각각의 샘플의 탈질능과 real-time PCR을 통해 얻어진 정량적 농도와의 관계를 비교하였다. 그 결과 nirS를 가진 탈질 미생물의 경우에는 대부분의 탈질미생물이 가지고 있어 양에 있어서는 주류이나, 탈질능에 영향을 미치는 범위에서는 nirK를 가진 탈질 미생물이 주어진 환경과 조건에 의해 그 양이 영향을 더 많이 받기 때문에 탈질능에 영향을 주는 주류라는 것을 확인하였다.

사사

 이 논문은 2008년 정부(교육과학기술부)의 한국학술진흥재단의 지원을 받아 수행된 연구임. (313-2008-2-D00556)

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