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ISSN : 1225-7672(Print)
ISSN : 2287-822X(Online)
Journal of the Korean Society of Water and Wastewater Vol.36 No.1 pp.33-44
DOI : https://doi.org/10.11001/jksww.2022.36.1.33

Characteristics of extracellular polymeric substances and dispersion by adding diffusible signal factor of a quorum sensing compound to
biofilm from MBR sludge strains

Wonjung Song1, Junhee Ryu1, Suyoung Choi1, Jihyang Kweon2*
1The Academy of Applied Science and Technology, Konkuk University
2Department of Civil and Envbironmental Engineering, Konkuk University
* Corresponding author: Jihyang Kweon (E-mail: jhkweon@konkuk.ac.kr)

19/01/2022 17/02/2022 18/02/2022

Abstract


Application of the membrane process to wastewater treatment and reuse has been increasing due to water shortage, water pollution and an increase in water demand. Membrane fouling including biofouling should be controlled to extend its application. In this study, modulation of diffusible signal factor (DSF) system, the quorum sensing (QS) system that regulates EPS formation by microorganisms, was considered as a promising option to manage biofouling. Among many DSF compounds, cis -2-Decenoic acids (CDA) was selected. The experimental results showed that, as the CDA concentration increased, the density and number of stained cells decreased. The lowest density was observed when the CDA concentration of 300 nM was applied. The EPS on membrane surface decreased with increasing concentration of CDA. The CDA dosing also affected the EPS composition. At the 300 nM CDA dose, the total EPS reduced by up to 57% and the protein fraction by 35%. This study revealed the biofilm reduction effect of CDA under various conditions for MBR sludge. The application of CDA can be adapted to control biofouling in the MBR process.



QS조절물질 DSF주입이 MBR슬러지 이용 미생물막의 EPS 특성 및 분산에 미치는 영향

송 원중1, 류 준희1, 최 수영1, 권 지향2*
1건국대학교 산업기술연구원
2건국대학교 사회환경공학부

초록


    1. 서 론

    하・폐수 및 재이용수 처리에 적용된 멤브레인 공정 의 효율적인 운전을 위해 가장 시급하게 해결해야하 는 문제는 막오염 저감이다 (Maletskyi, 2020;Obotey and Rathilal., 2020). 막여과 공정이 진행되면서 점차적 으로 막표면에 쌓인 유기물과 미생물에 의해 발생하 는 생물막(biofilm)에 의한 막파울링(membrane fouling) 은 바이오파울링(biofouling)으로서 하수처리 적용 멤 브레인 공정에서 일어나는 막 오염 중에 가장 높은 비중을 차지하며 또한 가장 제어하기 어렵다고 알려 져 있다 (Gkotsis et al., 2014;Nguyen et al., 2012;Tijing et al., 2015). 생물막오염은 막여과 공정의 효율 을 떨어뜨리는 데다 역세척이나 화학세정을 통해 제 거되므로 유지관리에 투입되는 에너지나 비용을 높이 게 되어 경제성을 저감시킨다 (Jung et al., 2014;Nguyen et al., 2012;Park et al., 2016). 또한 미생물에 의한 생물막은 분리막 시스템에서의 작동 중단 및 멤 브레인 교체를 유발할 수 있는 심각한 원인이기도 하 다 (Flemming, 2011;Siebdrath et al., 2019).

    미생물은 성장 환경에 관계없이 세포외 고분자물질 (extracellular polymeric substances, EPS)을 생성한다. 막 표면에 부착한 미생물 역시 EPS를 생성하여 유기 체의 외부 표면 주위에 매트릭스를 형성하고 고분자 매트릭스에 둘러싸인 biofilm 또는 바이오floc을 구성 한다 (Costa et al., 2018;Karyglanni et al., 2020;Laspidou and Rittmann, 2002). 미생물 셀 표면 또는 외 부에 존재하는 EPS는 생물막 구조를 안정화하고, 유해 환경으로부터 셀을 보호하는 역할을 하지만 더불어 막 여과 과정에서 여과저항을 발생시키고, 분리막 생물반 응조(membrane bioreactor, MBR) 막오염의 주요 요인으 로도 작용한다 (Drews et al., 2007;Nuengjamnong et al., 2005;Teng et al., 2020).

    EPS는 탄수화물, 다당류, 단백질, DNA, 지질 등의 복잡한 혼합물로 구성되며, 다당류와 단백질이 대부 분을 차지한다. EPS내 다당류(polysaccharide)는 응집 력, 스캐폴딩, 안정성, 세포 간 결합 등에 기여하고 (Hobley et al., 2015;Karygianni et al., 2014;Ogran et al., 2019), 개별 세포의 보호막으로서 외부로부터의 스트레스를 방어하며 생물막 내 존재하는 세포의 장 벽으로 작용한다 (Cooke et al., 2019;Reichhardt et al., 2019). EPS의 단백질은 매트릭스의 중요 구성요소이 며 접착력, 세포 간 결합 등을 일으키고, 생물막의 구 조적 안정성에 기여한다 (De Jong et al., 2009;Dresche et al., 2016;Duanis-Assaf et al., 2018). 형성된 단백질 은 세포 접착과 박테리아 세포 간의 결합을 촉진하며, 이는 구조화 된 세포 클러스터, 즉 마이크로 콜로니의 생성으로 이어진다 (Bowen et al., 2018).

    미생물간 신호물질조절로 초기 부착단계를 제어 하여 바이오파울링을 저감하는 연구가 진행되어 왔 으며, 최근에는 EPS 형성을 조절하는 신호체계에 대 한 연구로 관심이 옮아가고 있다. 미생물간 의사소 통체계인 정족수감지(quorum sensing, QS) 시스템은 다양한 메카니즘으로 작동하는데, 대표적인 신호물질 인 그람음성균에 작동하는 아실-호모세린 락톤 (acyl-homoserine lactone, AHL)이 알려져 있다 (Papenfort and Bassler, 2016). AHL시스템의 상위체계 로서 확산성 신호전달 인자(diffusible signal factor, DSF)를 이용하는 시스템이 존재하는데 DSF계 신호 물질은 cis-불포화 이중결합이 존재하는 특징이 있으 며 두 번째 cis-불포화 이중결합의 존재여부나 사슬구 조의 길이가 조금씩 상이하다. 생물막 형성 미생물로 잘 알려진 Pseudomonas aeruginosa에서 발견된 DSF계 신호물질은 cis-Decenoic acid(CDA)가 대표적이다 (Dow et al., 2017). DSF 계열 신호 전달 물질은 지방 산을 이용한 신호로서, 미생물의 행동 양식을 변화시 키며, 운동성, 효소 생성, EPS 생성, 스트레스 반응, 항균 저항성 등에 관여한다.

    EPS 조절에 관여하는 DSF 신호체계를 설명하는 내 용은 다음과 같다. 두 번째 메신저(second-messenger) 분자인 c-di-GMP는 생물막 형성 메카니즘의 중요인자 로, 플랑크톤의 운동성을 전환시켜 고정된 생물막 형 성 상태로의 제어를 유발한다. 세포내 c-di-GMP 수준 이 증가하면 다당류계 EPS의 합성이 촉진되고, 미생물 간 또는 표면과의 응집을 유도되고 향상된다 (Schmid et al., 2012). DSF 신호 시스템은 c-di-GMP 농도수준을 조절하며, 신호 인식 및 변환을 위해 RpfF/RpfR의 두 가지 구성 요소가 작동한다. RpfF는 광범위한 박테리 아 종에서 DSF 계열의 신호 합성에 관여하는 효소로 서 DSF가 RpfR에 결합하면 단백질의 phosphodiesterase (PDE) 활성이 자극되고 결과적으로 세포내 c-di-GMP 수준이 낮아지고 이로 인해 생물막 분산이 유도된다 (Dow et al., 2017). 생물막의 분산은 생물막 형성의 마 지막 단계에서 발생하는 메커니즘으로서 생물막 내 미생물은 수용 액상으로 방출된다. 따라서 DSF 신호 물질을 이용하면 생물막의 EPS 조성 및 구조에 변화 를 가져옴으로써 생물막 분산이 유도할 수 있다고 판 단된다.

    따라서 본 연구에서는 MBR의 바이오파울링 제어 를 위해 DSF 신호물질인 CDA를 적용하여 미생물 분 산을 유도하고 이를 통해 하수처리공정의 생물막을 제어할 수 있는 방법을 탐색하고자 하였다. 기존연구 는 CDA 주입에 의한 Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis및 Staphylococcus aureus와 같은 단일 균주의 분산 유도에 한정되어 있었다 (Davies and Marques, 2009;Rahmani-Badi et al., 2015). 특히 다양한 균주를 이용하여 폐수 내 유기물을 처리하는 MBR 공정에서 발생하는 생물막 제어 목적의 DSF 시스템을 적용한 연구는 전무하다. 따라서 본 연구는 c-di-GMP 수준 을 조절하는 CDA를 적용하여 DSF 시스템의 발현을 조절하며 이를 통해 바이오파울링을 저감시키고자 하였다. MBR공정 적용을 염두에 두고 실제 하수처 리장의 MBR 슬러지를 샘플링하여 CDA 적용하고, EPS 구성 및 구조의 변화를 중심으로 생물막저감을 평가하였다.

    2. 실험재료 및 방법

    2.1 실험재료

    CDA(≥ 95.0% HPLC grade)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 표준용액은 10% 에탄 올에 녹여 1000 mg/L 농도로 준비하였다. 표준용액을 6.82 μL, 13.62 μL, 20.44 μL를 취하여 반응조에 주입 하여 반응조 CDA 농도를 각각 100 nM, 200 nM, 300 nM가 되도록 하였다. 실험에 사용한 슬러지는 경기도 G시 하수처리장의 MBR에서 채수하였다. 샘플링된 슬러지의 MLSS는 5200~6500 mg/L였으며, 슬러지는 샘플링 후 24시간 뒤 실험에 사용되었다. 실험 전 각 각의 설정된 MLSS 농도 조건을 맞추기 위해 인공원수 를 주입하였으며, 반응조내 COD 농도를 550 mg/L로 하였다. 인공원수는 glucose, yeast extract, bactopentone, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4, FeCl3, CaCl2, MnSO4, NaHCO3를 이용하여 5500 mg/L COD로 준비하였으며, 실험시 희석하여 사용하였다.

    2.2 CDC 반응기 이용 생물막 형성 실험

    MBR 슬러지의 생물막 형성에 CDA의 농도 변화가 미치는 영향을 파악하기 위해 CDC 반응기(BioSurface Technologies Corp., Bozeman, MT, USA)를 이용하였 다. 실험 시작시 각각의 CDC 반응기에 400 mL의 MBR 슬러지를 채웠으며, 대조군은 CDA를 주입하지 않은 조건에서 수행되었다. CDC 반응기의 운전은 CDA가 포함된 400 mL의 MBR 슬러지를 채워 150 rpm으로 교반하며 1일, 3일, 5일 동안 설정된 조건에 서 수행하였다. 반응조내 탄소원 유지를 위해 인공 원수는 24시간마다 주입되었다. CDC반응기내 시료 막대(rod)에 부착된 분리막은 폴리비닐리덴 플로라 이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 재질의 0.22 μm 정밀 여과 평막(Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 으로, 분리막 시편을 1.5 cm x 1.5 cm 크기로 준비하 여 각각의 시료막대 한면에 두 개의 시편을 부착시켰 다. 시료막대는 분리막이 반응기 내부를 향하도록 배 치하였다.

    2.3 EPS 추출 및 분석

    멤브레인 표면에 형성된 EPS의 추출을 위해 열적 추출 방법을 적용하였다. 막을 CDC 시료막대에서 조 심스럽게 제거하고 잔류물을 0.9% NaCl 20 mL로 세척 하였다. 세척 후, 막을 15 mL의 0.9% NaCl과 함께 코 니컬튜브(conical tube)에 옮겨 5분간 볼텍싱(voltexing) 후 60분 동안 초음파발생기(B5510, Branson Ultrasonics, USA)를 이용하여 처리하였다. 이후, 막을 제거하고 생물막 추출을 위해 원심 분리(1736R, LABOGENE, Korea)를 진행하였다(12,000 g, 20분, 4˚C). 원심 분리 후, 생물막 분획만을 취하기 위해 상등액을 제거하였 으며, 동량의 0.9% NaCl을 추가한 후 오븐(JSOF-150, JS Research Inc., Korea)을 이용하여 열처리를 진행하 였다. 열처리는 100˚C에서 60분 동안 가열을 진행하였 으며, 가열이 끝난 후 실온에서 냉각시켰다. 냉각된 샘플은 원심 분리(12,000 g, 20분, 4˚C) 후 상등액을 0.45 μm 시린지 필터로 여과하였다. 추출된 샘플은 단 백질과 다당류 분석을 실시하였다.

    단백질은 Bradford법으로 측정하였다. 단백질의 정 량은 흡광도로 측정하기 때문에 2 mg/ml의 bovine serum albumin(BSA) 표준용액을 이용하여 표준곡선을 만들었다. 표준용액을 0~10 μg/ml이 되도록 단계별로 희석하여 표준용액을 준비하고 각 시료와 단백질 염색 약 1 ml을 큐벳에 넣어 10분간 정치한 후 595 nm에서 흡광도를 측정했다. 표준용액의 흡광도 결과로부터 일 차회귀 직선식(y = 0.0602x + 0.0031, R2=0.9971)을 얻어내어 시료의 단백질을 산출하였다. BSA 표준용액 과 염색약은 Protein Assay Kit(BR500, Bio-rad, USA)를 사용하였다. 흡광도 측정 시에는 분광광도계(Genesys 10 UV/vis spectrophotometer, Thermo Scientific, USA) 를 사용하였다. 다당류의 정량은 시료를 5배 희석한 뒤 유기탄소분석기(TOC analyser, Sievers 5310C, GE, Australia)를 사용하여 측정하였다.

    2.4 공초점 레이저 주사 현미경 이용 막표면 분석

    공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM) 분석을 수행하여 막표면의 바이오 필름 관찰하였다. CLSM을 이용한 막표면 분석은 SYTO9과 propidium iodide로 구성된 Live/Dead cell kit(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 분리막을 염색 후 진행하였다. CDC반응기 운전 종료 후, 생물 막이 형성된 분리막은 염색을 위해 페트리디쉬에서 Live/Dead cell kit 200 μL(50 μL씩 4회)을 표면에 도포 한 후 암막 상태에서 15~20분간 반응시켰다. 반응이 종료된 분리막은 증류수로 잔류물을 조심스럽게 세척 하고 분석을 실시하였다. CLSM 분석은 LSM 710 (ZEISS, Germany)을 사용하여 3D stack 이미지 수집하 였다. 분석은 20배율 렌즈를 이용하여 1024 × 1024 μm2 의 면적에 대해 분석을 진행하였다. 멤브레인 표면에 형성된 생물막의 이미지 분석은 소프트웨어 Zen 2012 를 이용하였으며, 생물막 구조를 정량화하기 위해 이 미지 분석 소프트웨어 COMSTAT을 사용하여 3D 스 택이미지를 정량화하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1 DSF농도가 바이오필름 형성에 미치는 효과

    3.1.1 바이오필름 형성 결과: CLSM 이미지

    CDA의 주입농도가 각각 100 nM. 200 nM, 300 nM 일때 막 표면에 형성된 생물막의 CLSM 이미지를 전 체, live cell, dead cell 로 나눠 Figure 1에 나타냈다. MBR 슬러지의 MLSS 농도는 5200 mg/L 이었고, 이 슬러지를 CDC 반응기에서 하루 배양한 후 막표면에 생긴 바이오필름을 CLSM으로 분석한 결과이다. 염료 로 인해 live cell은 녹색 형광을 띄고, dead cell은 붉은 형광으로 표시되었다. CLSM 이미지는 CDA농도가 높 아짐에 따라 분리막 표면의 녹색이 줄어들면서 live cell의 밀도와 개체수가 감소한 것을 확인할 수 있다. CDA가 적용되지 않은 대조군의 분리막의 표면과 비 교시 적용된 100 nM의 CDA에 의한 개체수 감소로 live cell의 밀도가 약간 감소하는 것을 확인 할 수 있 다. 200 nM과 300 nM CDA가 적용된 조건에서 역시 CDA에 의한 생물막 분산으로 막 표면의 live cell(green) 개체수의 감소를 확인할 수 있다. 막표면의 dead cell(red) 역시 농도에 따른 변화가 관찰되었다. Live cell과 마찬가지로 CDA의 농도가 높아질수록 표 면의 dead cell 밀도가 감소하는 것을 확인하였으며, 300 nM의 CDA가 적용된 조건에서 가장 낮은 밀도로 관찰되었다.

    3.1.2 바이오필름 구조 특성 결과: COMSTAT

    바이오필름이 얼마나 두껍게 혹은 어떤 형태로 구 축되었는지 평가하기 위해 앞의 CLSM 이미지를 정량 분석하였다. 정량 분석에 이용한 소프트웨어는 COMSTAT이었고, 총개체량(total biomass, μm3/μm2), 표면적 대 부피비(surface to biovolume ratio, SBR, μm2/μm3), 평균두께(mean thickness, μm) 그리고 거칠 기 계수(roughness coefficient, -)를 구하였다. 총개체량 은 면적내 존재하는 바이오매스를 포함하는 모든 복 셀(voxel, 즉, 픽셀의 3차원 부피)을 면적으로 나눈 값 으로 결정되며, 평균 두께는 생물막의 기공 또는 공극 을 제외하고 순전히 생물막의 두께만을 계산한 값을 나타낸다. 거칠기 계수는 분석 구역 내 생물막의 높이 변화율을 나타낸다. 표면적 대 부피비(SBR)는 생물막 의 구성요소 중 공극에 대한 지표로서 생물막 내 양 분이 공급되는 통로의 비율을 의미하며, 분산이 많이 일어나는 조건에서 SBR 값이 크게 나타날 것으로 판 단된다.

    COMSTAT을 이용한 CLSM 이미지의 정량 분석 결 과는 Table 1에 나타냈다. 결과에서 총 개체량은 live cell과 dead cell의 합으로, SBR과 평균 두께는 live cell 과 dead cell의 평균으로 나타냈다.

    CDA의 주입이 없는 대조군의 경우 총 개체량은 0.098 ± 0.007 μm3/μm2로 나타났다. 반면 CDA 주입농 도 100 nM, 200 nM, 300nM에 따라 총계체량 (μm3/μm2)은 0.080 ± 0.004, 0.063 ± 0.005, 0.056 ± 0.000로 감소함을 확인하였다. 총 개체량이 감소함에 따라 각 조건의 평균 두께(μm)가 감소하였으며, 주입 농도에 따라 1.099 ± 0.026, 1.064 ± 0.008, 1.061 ± 0.008로 감소한 수치를 나타냈으며, 300 nM CDA 주 입 조건에서 약 17% 감소하였다. 표면적 대 부피비, 거칠기 계수는 총계체량, 평균 두께와 반대로 적용된 CDA의 농도가 높아질수록 증가하는 모습을 나타냈 다. 표면적 대 부피비(μm2/μm3)는 100 nM CDA 조건 에서 11.959 ± 0.030로 낮은 수치를 나타냈지만 200 nM과 300 nM 적용시 각각 9.494 ± 0.038, 17.071 ± 4.290로 변화하였다. 거칠기 계수(-)의 경우 적용된 CDA에 의해 큰 변화를 나타내지는 않았지만 점차적 으로 증가하는 경향은 존재하였다.

    P. aeruginosa PAO1을 대상으로 한 생물막 제어 타 연구에서도 배지에 포함된 CDA의 농도가 1 nM, 1 μM, 1 mM로 증가함에 따라 총 개체량(2.4~8.5배), 평 균 두께(2.2~8배)의 감소를 확인하였으며, 이는 CDA 에 의한 생물막 분산의 영향이라 밝혔다 (Marques et al., 2015).

    3.2 DSF 접촉 시간이 바이오필름 형성에 미치는 효과

    3.2.1 바이오필름 이미지 및 구조특성 결과

    CDA와의 접촉시간이 늘어남에 따라 막 표면에 나타 나는 바이오필름 억제 및 분산 정도를 확인하기 위해 접촉시간을 1일, 3일, 5일로 하여 CDC reactor를 운전하 였다. 이때 MBR 슬러지의 MLSS 농도는 5200 mg/L이 었고, 주입된 CDA 농도는 100 nM이었다. 운전 종료 후 분석된 각 조건의 CLSM 이미지와 COMSTAT 결과를 각각 Figure 2와 Table 2에 나타냈다. CDA의 주입이 없는 조건에서는 CDC reactor의 운전시간이 증가함에 따라 MBR 슬러지에 의해 형성되는 생물막이 증가하 는 것을 CLSM 분석 결과를 통해 확인할 수 있다. 반 면 100 nM의 CDA 주입시에는 접촉시간 증가했어도 막 표면에 형성된 생물막의 변화가 거의 없었다.

    CLSM 이미지 정량분석결과, CDA와의 접촉시간이 증가함에 따라 MBR 슬러지에 의해 막표면에 발생하 는 biomass는 감소한 것을 확인할 수 있었다. CDA의 주입이 없는 대조군은 0.098 ± 0.007 μm3/μm2의 총 개 체량을 형성하였으며 접촉시간이 증가함에 따라 0.131 ± 0.011, 0.184 ± 0.132 μm3/μm2로 증가하였다. 평균두께는 하루 경과 시 1.284 ± 0.307 μm로, 3일 경 과 후 1.156 ± 0.031 μm로 5일 경과 후 3.682 ± 3.329 μm로 나타나 초반부에 변화가 관찰되지 않다가 증가 하는 현상을 보였다. 특히 5일 운전 조건에서는 두꺼 운 미생물막으로 인해 붉은색으로 표현되는 dead cell 이 분리막 표면에서 증가하는 것을 확인할 수 있다. 반면 100 nM의 CDA가 주입됐을 때 총 개체량은 0.080 ± 0.004, 0.051 ± 0.005, 0.042 ± 0.001 μm3/μm2로 접촉시간의 증가함에도 감소하였다. 평균 두께 역시 1.099 ± 0.026 μm에서 1.060 ± 0.005, 1.042 ± 0.006 μm로 주입된 CDA에 의해 접촉시간에 따라 점점 감소하였 다. 대조군의 경우 운전시간이 길어짐에 따라 막표면 에 형성되는 바이오필름에 의해 거칠기 계수가 1일차 의 1.989 ± 0.006 (-)에서 3일차에 1.983 ± 0.003 (-), 5 일 경과 후 1.958 ± 0.044 (-)로 소폭 감소하는 경향을 보였다. 100 nM의 CDA 주입 조건에서는 접촉시간이 늘어남에 따른 거칠기 계수는 1.995 ± 0.000 (-), 1.998 ± 0.000 (-), 1.999 ± 0.000 (-)로 나타났으나 그 변화는 미미하였다.

    3.2.2 EPS형성에 미치는 영향

    CDA와의 접촉시간 변화에 따른 막 표면 바이오필 름 구성 변화를 확인하기 위해 EPS를 추출하였으며, 다당류와 단백질로 구분하여 EPS를 분석하였다. Figure 3에 나타나듯이 5200 mg/L의 MLSS 농도에서 CDA의 주입이 없는 대조군의 경우, EPS는 5일의 배 양기간동안 초기 1.42 μgEPS/cm2에서 2.72 μgEPS/cm2 로 증가했다. 그러나 100 nM의 CDA주입 조건은 배양 시간이 증가함에도 막 표면에 발생하는 생물막이 감 소하는 경향을 나타냈다. 1일 경과 후 막표면의 EPS 는 1.34 μgEPS/cm2로 대조군에 비해 0.08 μgEPS/cm2 감소한 수치를 나타냈으나, 5일 경과 후 막표면의 EPS는 1.29 μgEPS/cm2로 약 52% 감소한 수치를 나타 냈다. MBR 슬러지를 주입한 CDC 반응기의 분리막 표면 EPS 농도는 접촉시간이 늘어남에 따라 증가하였 으나 CDA 적용 슬러지에서는 MBR 슬러지와는 반대 로 접촉시간이 늘어날수록 막 표면에 발생하는 EPS는 감소하였다.

    생물막오염 저감을 위해 MLSS 5000 mg/L의 MBR 슬러지에 바닐린을 적용한 연구는 125 mg/L 이상의 바닐린 적용시 24시간의 접촉시간 동안 막표면에 발 생하는 생물막을 25% 이상 저감 가능하다고 보고하 였다 (Nam et al., 2015). 본 연구는 5일의 접촉시간 동 안 EPS의 증가가 관찰되지 않았으며, 이는 적용된 CDA가 슬러지 내 미생물의 분산을 효과적으로 유도 하여 막 표면의 생물막 형성을 감소시킨 것으로 판단 된다.

    EPS 분석 결과는 3.2.1의 CLSM 이미지 정량 분석 결과 중 총계체량의 변화와 유사하게 나타났다. COMSTAT 결과에서 CDA와의 접촉시간이 증가함에 따라 막표면의 총 개체량은 0.080 ± 0.004 μm3/μm2에 서 0.042 ± 0.001 μm3/μm2로 감소했으며, 총 EPS 역시 1.34 μgEPS/cm2에서 1.29 μgEPS/cm2로 감소하였다. 이 는 CDA의 분산유도로 인해 막 표면에서 생물막이 탈 착되면서 미생물 개체량의 감소와 동시에 총 EPS가 감소한 것으로 판단된다.

    CDA 주입시간이 증가하면서 EPS 농도가 감소하였 는데, 이때 EPS 구성성분의 변화 유무를 파악하기 위 해 다당류와 단백질로 구분하여 분석을 실시하였다. Figure 4에서, 대조군의 경우 초기 39%를 차지하던 단 백질은 3일 경과 후 43%, 5일 경과 후 42%로 초기보 다 높은 비율을 나타내었다. 반대로 CDA 주입 조건에 서는 1일, 3일의 접촉 시 단백질은 전체 EPS 중 37% 를 차지하였으며, 5일간의 접촉으로 인해 그 비율이 32%로 감소하였다. 즉, CDA주입에 따라 EPS가 감소 했을 뿐만 아니라, 감소된 EPS내의 단백질 함량도 줄 어들어 전체적으로 바이오필름내 단백질 함량이 상당 히 낮아졌음을 나타낸다. EPS 중 단백질은 미생물막 내에서 세포간 접촉력을 증가시키는 역할로 알려져 있다 (Lapsidou et al., 2002). CDA 주입에 의한 단백질 비율 감소는 총 EPS 농도 감소뿐만이 아니라 CDA가 EPS의 구성성분에도 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

    3.3 DSF 주입이 EPS 특성에 미치는 영향

    3.3.1 CDA 주입농도에 따른 EPS 변화

    총 EPS 농도와 EPS 구성성분의 변화를 CDA 주입 량, 접촉시간, 슬러지 농도에 따라 집중적으로 분석하 였다. Figure 5는 CDA 주입량 변화에 따른 EPS 결과 를 나타낸다. MLSS 5200 mg/L 슬러지를 이용하였고, 접촉시간 3일 조건에서 CDA 농도는 0, 100, 200, 300 nM를 적용하였다. CDA 주입 농도가 증가함에 따라 EPS 발생량은 각각 1.20, 1.04, 0.93 μgEPS/cm2로 낮아 졌으며, CDA를 주입하지 않은 대조군의 2.18 μgEPS/cm2에 비해 주입농도 300 nM에서 최대 57% 감소 하였으며 단백질과 다당류는 각각 65.8%, 50.8% 감소 하였다. 적용된 CDA에 의해 EPS 구성 역시 변화하였 다. CDA의 적용이 없는 경우 다당류와 단백질은 각각 57%와 43%의 구성비를 갖는다. CDA가 주입됨에 따 라 단백질의 비중이 감소되어 CDA 주입농도 100 nM 과 200 nM에서 단백질은 EPS 중 37%를 차지했으며, 300 nM의 주입은 단백질의 비중을 35%까지 감소시켰다.

    쿼럼 감지 억제물질(quorum sensing inhibitor, QSI)로 알려진 커큐민(curcumin, CCM)과 에피갈로카테킨 갈 레이트((–)-epigallocatechin gallate, EGCG)에 의한 생물 막 형성 평가 연구에서, MBR 슬러지에서 추출된 9종 의 박테리아에 의해 형성된 생물막은 적용된 두 물질 에 의해 초기 50 μg/cm2의 EPS에서 각각 17, 14 μg/cm2로 감소하였다 (Lade et al., 2015). 생강 추출물 에 의한 생물막 억제능을 평가한 또 다른 연구에서, 24시간의 배양시간 동안 P. aeruginosa PA14와 추출물 과의 접촉은 전체 EPS 중 단백질 27%와 탄수화물 31%를 감소시켰다 (Kim et al., 2013). 위 두 연구에서 적용된 물질의 농도는 CCM 150 μg/ml, EGCG 275 μg/ml, 생강 추출물 1%이었고, 본 연구에 적용된 CDA 는 nM 단위의 상당히 낮은 농도로 주입되었다.

    3.3.2 노출시간에 따른 EPS 변화

    CDA와 MBR 슬러지의 접촉시간 변화에 따른 EPS 변화를 확인하기 위해 300 nM CDA가 적용된 조건에 서 접촉시간을 1일, 3일, 5일로 하여 실험을 진행하였 다. Figure 6는 300 nM CDA 적용시 노출시간 증가에 따른 EPS의 구성 변화를 나타낸다. 대조군의 경우, 각 각의 배양기간에서 EPS는 1.42, 2.18, 2.72 μgEPS/cm2 로 증가했다. 반대로 300 nM CDA의 주입은 시간이 지남에 따라 막표면에 발생되는 EPS를 저감시켰다. 1 일의 접촉시간 경과 후 1.21 μgEPS/cm2을 나타낸 EPS 는 3일과 5일 경과 후 각각 0.93, 0.83 μgEPS/cm2로 적 용된 CDA에 의해 시간이 지남에 따라 감소하였다.

    3.2.2.절의 100 nM CDA 조건 결과와 마찬가지로 CDA의 적용시 접촉시간 증가에 따른 EPS의 증가는 관찰되지 않았고 오히려 300 nM의 CDA 적용 조건 결과는 증가된 CDA 적용 농도로 인해 시간이 지남에 따라 더 많은 EPS가 감소하는 결과를 나타냈다. 100 nM CDA 주입시 EPS는 접촉시간이 증가함에 따라 각 각 6%, 44.9%, 52.5% 감소하였다. 300 nM CDA의 적 용은 EPS의 저감 정도를 증가시켰다. 1일, 3일, 5일간 300 nM의 CDA 접촉은 총 EPS를 각각 14.7%, 57.3% 그리고 69.5% 감소시켰다. 즉, CDA 적용이 없는 대조 군의 경우 MBR 슬러지에 의해 시간이 지남에 따라 막 표면에 발생한 EPS는 증가하는 경향을 나타냈으 나, CDA 주입시에는 노출 시간이 증가함에 따라 막 표면의 EPS는 감소하였다.

    각각의 접촉시간에서 300 nM CDA에 의한 EPS 구 성 변화를 Figure 7에 나타냈다. 대조군의 EPS의 구성 은 CDC 반응기의 운전시간이 증가함에 따라 다당류 는 감소하며 단백질은 증가하는 경향을 나타냈다. Day-1에서 EPS의 구성은 다당류와 단백질이 각각 61%와 39%를 나타냈다. 다당류는 57, 58%로 접촉시 간이 길어질수록 비율이 감소하는 경향을 나타냈으 며, 단백질은 43, 42%로 증가한 수치를 나타냈다.

    300 nM CDA의 적용으로 인해 단백질의 비율 감소가 관찰되었다. Day-1의 조건에서 전체 EPS 중 34%의 구 성을 차지하던 단백질은 Day-3와 Day-5에서 각각 35%, 17%를 나타냈다. 이는 3.2.2절의 EPS 구성 결과와 유사하 며, 300 nM CDA에 의해 Day-5의 단백질 구성은 100 nM CDA 조건 결과와 비교하여 큰 폭으로 감소하였다.

    3.3.3 CDA주입효과에 대한 슬러지 농도 영향

    MLSS를 2500, 5200, 8200 mg/L로 하여 슬러지량이 CDA 주입 및 EPS 형성에 미치는 영향을 고찰하였다 (Fig. 8). 접촉시간은 3일을 적용하였고, 이때의 주입된 CDA농도는 300 nM 이었다. MBR 슬러지에 의해 형 성된 EPS는 CDA를 적용하지 않은 대조군과 CDA를 적용한 슬러지에서 모두 MLSS가 높을수록 증가된 수 치를 나타냈다. 대조군의 경우, MLSS가 2500 mg/L, 5200 mg/L, 8200 mg/L로 증가할 때 1.00 μgEPS/cm2, 2.18 μgEPS/cm2, 2.38 μgEPS/cm2로 증가하여 미생물의 개체수가 높으면 제한된 영양소의 소비가 가속화되고 미생물 간의 경쟁으로 인해 EPS 생성이 증가한다고 알려진 기존 논문과 부합하는 결과를 나타내었다 (Ghoul and Mitri., 2016, Yigit et al., 2008). 이러한 현 상은 CDA주입 슬러지에서도 유사하게 나타나, MLSS 증가에 따른 EPS 농도는 0.77 μgEPS/cm2, 0.93 μgEPS/cm2, 1.30 μgEPS/cm2이었다. 다만, EPS농도 자체 는 CDA주입 슬러지에서 상당히 낮게 나타났다. 벌크 상의 부유미생물이 생물막 형성에 참여하는 미생물을 공급한다고 볼 때, g MLSS당 EPS 생성율(μgEPS/cm2/g) 은 대조군에서 0.29~0.41의 값을 갖는 반면, CDA 적 용 슬러지에서는 0.15~0.31의 값을 나타내어 CDA 주 입이 EPS 생성율에 미치는 영향이 상당함을 알 수 있 었다.

    각 미생물 농도에서 동일한 3일간의 접촉시간 후 300 nM의 CDA 주입에 의한 효과를 살펴보면, MLSS 2500 mg/L의 조건의 EPS는 1.00 μgEPS/cm2에서 0.77 μgEPS/cm2로 감소했다. 5200 mg/L의 MLSS 조건에서 는 2.18 μgEPS/cm2에서 0.93 μgEPS/cm2로 감소하였고, MLSS 8200 mg/L에서는 2.38 μgEPS/cm2에서 1.30 μgEPS/cm2으로 감소하였다. 감소율은 각각 23%, 57%, 45%로서 MLSS가 2500 mg/L인 조건보다 MLSS 농도 가 높은 상황에서 그 효과가 크게 나타남을 알 수 있 었다.

    Davies and Marque (2009)는 형성된 생물막이 적을 경우, 세포외 기질에 축적된 유도 물질은 확산 및 이 류에 의해 제거될 가능성이 있다고 밝혔다. MLSS 2500 mg/L의 조건은 다른 두 조건보다 형성된 총 EPS 가 적어 주입된 CDA에 의한 분산이 효과적으로 유도 되지 못해 상대적으로 낮은 총 EPS 감소율을 나타낸 것으로 판단된다.

    QQ 박테리아를 이용한 생물막 연구에서도 대조군 의 EPS는 지속적으로 증가한 반면 QQ 박테리아를 적 용한 조건에서는 EPS가 저감되는 결과를 보여주었다 (Huang et al., 2019). 다만, 이 연구에서는 5일 접촉시 간 후 단백질과 다당류의 수치가 대조군에 비해 각각 26%, 23% 감소되어 CDA 적용의 본 연구보다는 낮은 값을 나타내었다.

    4. 결 론

    본 연구는 MBR 슬러지를 대상으로 CDA 농도와 접촉시간 변화에 따른 막표면의 생물막 변화를 관찰 하였으며 그 결과는 다음과 같다.

    • (1) 주입된 CDA농도가 높아짐에 따라 분리막 표면 미생물 밀도와 개체수의 감소, 그에 따른 생물 막 구조 변화를 확인하였다. 300 nM의 CDA에 서 가장 낮은 밀도를 나타냈으며, 생물막 구조 특성은 CDA 주입농도가 증가함에 따라 총계체 량과 평균 두께가 감소하며 표면적 대 부피비, 거칠기 계수가 증가하는 경향을 나타냈다.

    • (2) MBR 슬러지에 의해 형성되는 생물막은 시간이 지나면서 증가하였으나, 100 nM의 CDA 주입시 접촉시간이 증가했음에도 생물막의 구조적 변 화가 관찰되지 않았으며 총 개체량과 평균 두께 의 감소가 확인되었다.

    • (3) DSF 주입에 따른 EPS의 구성변화는 주입농도, 접촉시간에 의한 영향을 고려하였다. 긴 접촉시 간과 높은 CDA 농도는 단백질 구성을 큰 폭으 로 감소시켰으며, 최대 주입농도인 300 nM CDA에 의해 총 EPS는 최대 57% 감소하였다. 또한 미생물에 의해 형성된 EPS는 MLSS가 높 을수록 발생량이 증가하였으나, CDA주입시 그 증가 수준이 상당히 낮게 나타나 CDA주입이 EPS생성율에 미치는 영향이 상당함을 확인하였다.

    위의 결과를 통해 CDA의 적용은 슬러지 내 미생물 의 분산을 효과적으로 유도하여 막 표면의 생물막 형 성을 감소시킬 수 있을 것으로 판단되며 다른 생물막 관련 연구에서 적용된 물질과 달리 CDA는 상당히 낮 은 농도의 주입만으로도 EPS의 저감이 가능함을 확인 하였다. 이를 통해 MBR 공정에서의 생물막오염 제어 에 CDA의 적용이 가능할 것으로 판단된다.

    사 사

    이 연구는 2018년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(NRF-2018 R1A2B2005745).

    Figure

    JKSWW-36-1-33_F1.gif

    CLSM images of the biofilm with CDA doses of 0 nM, 100 nM, 200 nM, and 300 nM. (green : live cell, red : dead cell).

    JKSWW-36-1-33_F2.gif

    CLSM image of biofilm exposed to different contact times of 1 day, 3 day and 5 day. (green : live cell, red : dead cell).

    JKSWW-36-1-33_F3.gif

    EPS results of biofilm with different contact time.

    JKSWW-36-1-33_F4.gif

    Fraction of polysaccharide and protein in biofilm with different contact times (MLSS: 5200 mg/L, CDA dose: 100 nM).

    JKSWW-36-1-33_F5.gif

    EPS results of biofilm with different CDA concentration.

    JKSWW-36-1-33_F6.gif

    Total EPS with different contact time with the CDA dose of 300 nM.

    JKSWW-36-1-33_F7.gif

    EPS proportion change by 300 nM CDA.

    JKSWW-36-1-33_F8.gif

    The effect of 300 nM CDA at condition of different MLSS concentration(black: control, grey: w/ 300 nM CDA).

    Table

    Total biomass, surface to biovolume ration, mean thickness, and roughness coefficient analyzed from the COMSTAT program

    Total biomass, surface to biovolume ration, mean thickness, and roughness coefficient analyzed from the COMSTAT program at three different contact time

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